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    公开号:WO1990010014A1
    申请号:PCT/JP1990/000253
    申请日:1990-02-28
    公开日:1990-09-07
    发明作者:Tetsuo Toraya；Atsuhiko Ishida；Yasuhide Uejima；Katsuhiko Fujii
    申请人:Teijin Limited；
    IPC主号:C07H23-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 新規ビタ ミ ン B ,2誘導体、 その製造方法 並びにその用途 技術分野
    [0002] 本発明は、 新規なビタ ミ ン B ι ζ誘導体及びその塩、 その製 造方法並びにその用途に関する。 更に詳し く言えば、 一般式 ( I )
    [0003] C 0 H;
    [0004] ）
    [0005] C〇
    [0006] N H
    [0007] CH: c ？
    [0008] 、C .P— 0— R— B
    [0009] / II
    [0010] H 〇 〇 (式中、 Lはコ リ ン環のコバル トへの配位子を示し、 Bは複 素環式構造を有する塩基を示し、 Rは置換または非置換の炭 化水素基を示す。 ）
    [0011] で表わされるビタ ミ ン B 1 2誘導体、 その製造方法並びに、 そ れを有効成分として舍有するビタ ミ ン B 1 2拮抗剤、 細胞増殖 の抑制または阻害剤等に関する。 背景技術
    [0012] ビタ ミ ン B 1 2は、 ヒ トなど動物にとって必須の微量栄養因 子の一つであり、 哺乳動物においては、 特に肝臓に多く舍ま れる。 動物、 植物とも、 この物質を生合成することはできず- 微生物のみがこれを産生する。 ビタ ミ ン B 1 2の欠乏症として は、 特に悪性貧血が代表的であり、 巨赤芽球性造血、 メ チル マ口ン酸尿症、 ホモシスティ ン尿症、 神経障害等がみられる < ビタ ミ ン B 1 2は、 体内に吸収されると、 代謝的に活性な型で あるビタ ミ ン B , 2補酵素 （アデノ シルコバラ ミ ン） 及びメ チ ルコバラ ミ ンに変換され、 前者は、 例えばメ チルマロニル
    [0013] CoAムターゼなどの水素の移動を伴う酵素反応に、 後者は、 例えばメ チォニンシンターゼなどのメ チル基の移動を伴う酵 素反応において、 それぞれ補酵素として機能する。 特にメチ ルコバラ ミ ンは、 葉酸補酵素を介する 代謝にかかわるこ とによって、 チミ ジル酸の生合成に間接的に関与し、 細胞増 殖に重要な役割を果たしている。 従って、 ビタ ミ ン B 1 2群に 拮抗作用を示す化合物、 すなわちビタ ミ ン B 1 2拮抗体は、 D N A合成を阻害することによって、 細胞の増殖を抑制また は阻止すると考えられ、 腫癟細胞 （ガン細胞） に対して、 抗 腫瘍剤 （抗ガン剤） として有効に作用すると考えられる。 ま た、 微生物においても、 その増殖にビタ ミ ン B 12群が重要で あり、 ビタ ミ ン B 12拮抗体は、 抗菌剤としての作用を有する と考えられる。 また、 逆に、 ビタ ミ ン B 12掊抗体は、 これに 対する抵抗性を指標としてビタ ミ ン B 12高生産性を有する微 生物変異株のスク リ一ユングに役立つと考えられる。
    [0014] 従来、 各種ビタ ミ ン B 12誘導体が合成されており、 例えば、 コビル酸より、 化学的にあるいは微生物を用いて合成された、 ビタ ミ ン B 12群のィ ソプロパノ ールア ミ ン部（-NHCH2CH(CH3)0_) を、 例えば、 -NHCH(CH3)CH20-, -NHCH2CH2CH20- , -NHC(CH3) z CH20-, -NHCHzCH(C6H5)0- 、 または- NHCH2CH (CH2F) 0-等に置 換したビタ ミ ン B！ 2誘導体が、 ェシヱリ ヒア · コ リ (Escherichia coli)113- 3、 ラク トバチルス · ライ ヒマニ (Lactobacillus leichmannii ) に対して拮抗作用を示すことが知 られている （フ リ ー ドリ ッ ヒ、 Vi tamin Bi 2 und verwandte Corrinoide(Georg Thieme Verlag, Stuttgard) , 289 - 308頁、 1975年） 。 また、 微生物から単離されたコバル ト欠如コ リ ノ ィ ド、 またはコバル ト欠如コ リ ノ ィ ドに、 例えばロジウム、 銅、 亜鉛を導入した異種金属コ リ ノ ィ ドも、 前記の菌に対し て同様に拮抗作用を示すことが知られている。 （フリードリ ヒヽ Vitamin B 12 und verwandte Corr inoide (Georg Thieme Verlag, Stuttgard) , 289-308頁、 1975年、 及びコベンハー ゲン、 B 12(John Wiley & Sons, New York) 、 Π巻、 105-149 頁、 1982年） 。 しかしながら、 コビル酸を用いる場合には、 その調製が複 雑で大量供給が困難であり、 微生物を用いる場合には、 その 単離の点で実用性に問題がある。
    [0015] また、 コ リ ン環の C一 10位に臭素、 もし く はニ ト ロ基を導 入したビタ ミ ン B 12誘導体、 また、 コ リ ン環周辺側鎖を、 例 えばカルボキシル基、 ェチルア ミ ド、 ァニリ ド、 ヒ ドラジ ド に置換したビタ ミ ン B 12誘導体も化学的に合成されている 、フリー ドリ ッ ヒ、 Vitamin B 12 und verwandte Corrinoide (Georg Thierae Verlag, Stuttgard) s 289 - 308頁、 1975年） が、 これらの誘導体は拮抗作用の点で未だ不充分である。 従って、 ビタ ミ ン B 12拮抗作用に優れ、 かつ大量供給可能 なビタ ミ ン B！ 2拮抗体が望まれていた。 発明の蘭示
    [0016] 従って、 本発明は、 ビタ ミ ン B 1 Z拮抗作用に優れ、 かつ大 量供給可能な新規なビタ ミ ン B 12拮抗体を提供することを目 的とする。
    [0017] 本発明はまたビタ ミ ン B 12拮抗作用に優れかつ大量供給可 能なビタ ミ ン B 12誘導体の製造方法を提供することを目的と する。
    [0018] 本発明は更に新規なビタ ミ ン B 12拮抗剤を提供することを 目的とする。
    [0019] 本発明は更にまた新規な細胞増殖抑制又は阻害剤を提供す ることを目的とする。
    [0020] 本発明は更にまた新規な抗腫瘍剤を提供することを目的と する。
    [0021] 本発明は更にまたビタ ミ ン B ,2高生産性微生物変異株をス ク リ ーニングする方法を提供することを目的とする。
    [0022] 本発明のその他の目的及び利点は以下の説明から明らかで ある。
    [0023] 本発明に従えば、 一般式 （ I )
    [0024] ェ
    [0025]
    [0026] CH- 〇
    [0027] I
    [0028] 、、C .P 〇一 R— B
    [0029] II
    [0030] I 〇 〇 (式中、 Lはコ リ ン環のコバル トへの配位子を示し、 Bは複 素環式構造を有する塩基を示し、 Rは置換または非置換の炭 化水素基を示す。 ）
    [0031] で表わされるビタ ミ ン B , 2誘導体及びその塩並びにそれを有 効成分として舍むビタ ミ ン B 1 Z拮抗剤並びに細胞増殖抑制又 は阻害剤、 抗腫瘍剤が提供される。 図面の簡単な説明
    [0032] 第 1図は、 本発明のビタ ミ ン B 12誘導体の、 マウス白血病 L 1 Z1。細胞に対する in vitro増殖阻害活性を示す。
    [0033] 図中、 Aはコ ン ト ロールを示し、 また Bはメ ソ ト レキセー ト（MTX) (200nM) 、 Cは M T X (200πΜ) と実施例 2で得られ たビタ ミ ン Β 12誘導体（50nM)、 D及び Εは、 Μ Τ X (200ηΜ) と実施例 5で得られたビタ ミ ン Β 12誘導体を各々 50ηΜ及び 5000ηΜを添加した結果である。 発明を実施するための最良の形態
    [0034] 本発明者らは、 前記した従来技術の問題点を解決すべく、 鋭意研究を進めた結果、 ビタ ミ ン Β 12群のヌク レオチ ド部分 のリボース部を修飾することによつて得られる一般式 （ I ) のビタ ミ ン Β 12誘導体は、 大量供給可能であり、 かつビタ ミ ン Β 12拮抗体として、 優れた作用を有することを見出した。 一般式 （ I ) で表わされるビタ ミ ン Β 12誘導体において、 Lはコ リ ン環のコバル トへの配位子を示す。 Lによって示さ れる配位子の例としては、 シァノ基、 置換もし く は非置換の アデノ シル基も し く はアデニニルアルキル基 （アルキル基は、 炭素数 1 〜 8 の直鎖、 または分枝鎖のアルキル基） 、 ヒ ドロ キシル基、 水分子、 又は炭素数 1 〜 8 の直鎖も し く は分枝鎖 のアルキル基等が挙げられ、 更に、 Lがこれらの基の同一若 しく は異なる 2個で表わされることもある。 かかる炭素数 1 〜 8 のアルキル基としては、 好まし く はメ チル基、 ェチル基、 プロビル基が挙げられる。 配位子 Lは、 一般にはコ リ ン環の 上方に配位するが、 コ リ ン環のいずれか片側にあってもよい し、 またその両側に存在してもかまわない。
    [0035] 一般式 （ I ) において、 Rは置換または非置換の炭化水素 基であって、 例えば、 芳香族基もし く はハロゲン原子で置換 された、 または非置換の炭素数 1 〜 8の直鎖もしく は分枝鎖 のアルキレン基、 または環状の炭化水素基が挙げられる。 な かでも、 炭素数 1 〜 8 のアルキ レン基が好ましい。
    [0036] —般式 （ I ) において、 Bは、 複素環式構造を有する塩基 を示し、 例えば、 置換もし く は非置換のィ ミダゾール基、 ピ リ ジン基、 またはそれらの誘導体等が挙げられる。 かかる誘 導体としては、 ィ ミダゾール基にベンゼン環が縮合したベン ズイ ミダゾール基、 またはその誘導体である 5 , 6 —ジメチ ルベンズィ ミダゾ一ル基等が挙げられる。 かかる塩基 Bは、 通常コ リ ン環のコバル トの下方に配位しているが、 本発明に おいては、 配位していない場合も舍まれる。
    [0037] また、 本発明は、 一般式 （ I ) で表わされるビタ ミ ン B 1 2 誘導体の製造方法である。
    [0038] すなわち、 ①シァノアクアコビンア ミ ドもしく はジシァノ コビンア ミ ドを、 次式 （ E )
    [0039] Β - β - 0 - Ρ03Η2 ( Π )
    [0040] (式中、 Β及び Rは前記式 （ I ) の定義に同じ。 ） で表わさ れるリ ン酸エステル誘導体又はその塩と反応させ、 Lがシァ ノ基である対応する一般式 （ I ) で表わされる化合物を製造 する。
    [0041] 一般式 （ Π ) で表わされる化合物と、 シァノ アク—アコビン アミ ドもしく はジシァノ コビンアミ ドとの反応は、 例えば縮 合剤、 好まし く はジシク ロへキシルカルポジィ ミ ドを用いて、 有機溶媒中、 好まし く はピリ ジン及び Ν , Ν —ジメ チルホル ムア ミ ドの混合溶液中で行なう ことができる。 反応温度は、 用いた溶媒の沸点以下で、 例えば室温付近が好ましい。 シァ ノ アクアコビンア ミ ドは、 ビタ ミ ン Β 1 Ζ (シァノ コバラ ミ ン） もし く はジシァノ コビンアミ ドより容易に調製される。 反応 の結果得られた、 Lがシァノ基である一般式 （ I ) で表わさ れる化合物は、 例えば抽出、 カ ラムク ロマ トグラフ ィ ー、 及 び （または） 高速液体ク口マ トグラフ ィ一により精製できる。
    [0042] あるいは② Lがシァノ基である一般式 （ I ) で表わされる 化合物を、 還元し、 次いで a ) 再酸化することにより、 ある いは b ) アルキル化、 次いで光分解することにより、 Lがヒ ドロキシル基、 または水分子である一般式 （ I ) で表わされ る化合物にするか、 あるいは③ Lがシァノ基、 ヒ ドロキシル 基、 または水分子である一般式 （ I ) で示される化合物を、 例えば水素化ホゥ素ナ ト リ ウム、 亜鉛と塩化ァ ンモニゥム、 亜鉛と酢酸、 または 2価のク ロムで還元し、 次いで、 例えば ハロゲン化アルカ ン （アルキル基は、 炭素数 1〜 8の直鎮、 または分 鎖のアルキル基、 好まし く は、 メ チル基、 ェチル 基、 プロビル基） 、 またはハロゲン化もし く は トシル化され た置換もし く は非置換のアデノ シンもし く はアデニニルアル カ ン （アルキル基は、 炭素数 1〜 8の直鎮、 または分技鎖の アルキル基） 例えば好ましく は 5 ' —ハロー 5 ' —デォキシ アデノ シンと反応させ、 対応する一般式 （ I ) で表わされる 化合物を製造することができる。 これらの化合物は、 例えば 抽出、 カラムクロマ トグラフィーにより、 精製物として得る ことができる。 得られた一般式 （ I ) で表わされる化合物を、 例えば硫酸等と塩を形成せしめることもできる。
    [0043] さ らにまた、 本発明は、 一般式 （ U ) で表わされる リ ン酸 ェステル誘導体及びその塩、 並びにその製造方法に関する。 これらのリ ン酸エステル誘導体及びその塩は、 一般式 （ I ) で表わされる本発明のビタ ミ ン B 12誘導体製造に用いられる 有用な中間体であり、 以下の方法によつて得ることができる。
    [0044] すなわち、 一般式 （ Π ) で表わされる リ ン酸エステル誘導 体及びその塩は、 複素環式構造を有する遊離の塩基 B ' と次 式 （ m )
    [0045] X-R-0H ( I )
    [0046] (式中、 Xは脱離基を示し、 Rは前記式 （ I ) の定義に同じ。 で表わされる化合物とを反応させ、 次式 （IV)
    [0047] B-R-OH (IV)
    [0048] (式中、 B及び Rは前記式 （ I ) の定義に同じ。 ） で表わさ れる化合物を得、 次いで、 これをリ ン酸化、 好ま し く は 2— シァノ エチルリ ン酸ビリ ジン塩を用いてリ ン酸化することに より製造される。
    [0049] 複素環式構造を有する遊離の塩基 B ' は、 例えば置換もし く は非置換の、 イ ミダゾール、 ビリ ジン、 またはそれらの誘 導体であって、 ィ ミダゾール誘導体としては、 例えば、 ベン ズイ ミダゾール、 または 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾ一 ル等が挙げられる。 これらの化合物 B ' は、 市販品として得 ることができ、 または公知の方法によって製造することがで きる。
    [0050] 一般式 （ m ) で表わされる化合物において、 Xは、 例えば ハロゲン原子、 好ましく は塩素からなる脱離基を示す。 一般 式 （ n ) で表わされる化合物は、 市販品として、 または公知 の方法により得ることができる。
    [0051] 複素環式構造を有する遊離の塩基 B ' と、 一般式 （ H ) で 表わされる化合物の反応は、 塩基、 好ましく は水素化ナ ト リ ゥム、 又は炭酸カ リ ウムの存在下で、 反応温度は、 好ま し く は室温付近で行われ、 また還流加熱下で行なつてもかまわな い。 この反応は、 有機溶媒中、 好ましく は N , N—ジメ チル ホルムアミ ド、 またはジォキサン中で行われる。 反応生成物 である一般式 （IV ) で示される化合物は、 粗製物として以下 の反応に用いることができるが、 好ましく は公知の方法、 例 えば洗浄、 抽出、 またはカラムク ロマ トグラフィ一により、 反応混合物から分離精製して用いられる。
    [0052] 一般式 （IV ) で表わされる化合物のリ ン酸化は、 例えば縮 合剤の存在下で、 好まし く は 2 —シァノヱチルリ ン酸ピリ ジ ン塩を用い、 次いで水酸化リチウムと反応させることにより 行なわれる。 縮合剤としては、 ジシク ロへキシルカルボジィ ミ ドが好ましく、 反応は、 有機溶媒中、 好まし く はビリ ジン 中で行なわれ、 反応温度は、 用いた溶媒の沸点以下で、 好ま し く は室温付近で行なわれる。 2—シァノ エチルリ ン酸ピリ ジン塩は、 テナーの方法 （J.Ara.Chem.Soc. , 83卷、 159-168 頁、 1961年） に従い、 2—シァノ ェチルリ ン酸バリ ゥム塩か ら容易に調製することができる。 反応生成物である一般式 ( E ) で表わされる化合物は、 粗製物として、 一般式 （ I ) で表わされるビタ ミ ン B , 2誘導体製造の中間体に用いること ができ、 所望により、 公知の方法、 例えば濾過、 抽出、 また はカ ラムク ロマ トグラフ ィーにより、 反応混合物から分離精 製することができ、 あるいは、 所望により、 公知の方法によ り、 例えばリ チウム、 ナ ト リ ウム、 カ リ ウム、 ノ リ ウムまた はピリ ジン等との塩の形で得ることができる。
    [0053] 一般式 （ I ) で表わされるビタ ミ ン B , 2誘導体は、 非常に 有益な薬理学的性質を備えている。 これらの化合物は、 ビタ ミ ン B 12拮抗体としての作用を有し、 ビタ ミ ン B 12¾抗剤と して使用することができ、 既知のビタ ミ ン B 12拮抗体と比べ ても、 優れた拮抗作用を示す。 さらに、 一般式 （ I ) で表わ されるビタ ミ ン B 12誘導体は、 前記製造方法により、 原料と してシァノ アクアコ ビンア ミ ドも し く はジシァノ コビンア ミ ドを用いるため、 既知のビタ ミ ン B 12拮抗体に比べても、 簡 便、 かつ大量に供給することができる。 また、 本発明の一般 式 （ I ) で表わされるビタ ミ ン B , 2誘導体は、 その少なく と も 1種を有効成分として舍有する細胞増殖抑制または阻害剤、 例えば、 細胞が微生物の場合は、 抗菌剤として、 又は細胞が 動物細胞、 特に腫瘍細胞 （ガン細胞） の場合は、 抗腫瘍剤 (抗ガン剤） として用いることができる。 かかる細胞増殖抑 制または阻害剤として用いる場合には、 一般式 （ I ) で表わ されるビタ ミ ン B 12誘導体の少なく とも 1種の有効成分と医 薬的に許容される担体及び （または） 必要な添加物とからな る医薬的調製物とすることができる。
    [0054] 本発明の一般式 （ I ) で表わされるビタ ミ ン B 12誘導体は, ビタ ミ ン B 12群に対して拮抗的に作用するため、 例えば、 ビ タ ミ ン B 12を高生産する微生物に対しては、 一般式 （ I ) で 表わされるビタ ミ ン B 12誘導体の増殖阻害作用は弱く なるか- またはその阻害作用を示さなく なる。 従って、 本発明は、 ビ タ ミ ン B i 2高生産性微生物変異株のスク リーニングの目的で. 本発明のビタ ミ ン B12誘導体を使用することも対象としてい る。
    [0055] 以上述べた様に、 本発明のビタ ミ ン B 12誘導体は、 ビタ ミ ン B lz拮抗体としての作用を有し、 酵素反応におけるビタ ミ ン B 12群の、 例えば補酵素機能の研究において、 非常に有用 である。 さらに、 本発明のビタ ミ ン B 12誘導体は優れた拮抗 作用を示し、 かかるビタ ミ ン B 12誘導体を有効成分として舍 有する細胞増殖抑制または阻害剤は、 例えば抗菌剤、 または 抗腫瘍剤 （抗ガン剤） として有用である。 また、 本発明のビ タ ミ ン B 12誘導体は、 ビタ ミ ン B 12高生産性微生物変異株の スク リー二ングに使用するこ とができる。 さ らに、 本発明の ビタ ミ ン B 1 2誘導体は、 原料としてシァノアクアコビンア ミ ドもしく はジシァノ コビンア ミ ドを用いるため、 簡便かつ大 量に供袷可能である。
    [0056] 本発明の前記一般式 （ I ) のビタ ミ ン B 1 2誘導体及びその 医薬的に許容される塩はそれ自体単独で投与してもよいが、 必要又は所望により他の通常の医薬的に許容される汎用の担 体、 賦形剤、 溶剤、 希釈剤等と混合して所望の剤型として経 口的又は非経口的に投与することができる。 経口投与剤は、 錠剤、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 液剤、 懸濁剤、 カプセル剤等の いづれであってもよい。 非経口的投与剤は、 皮下、 および皮 膚用軟裔、 ク リーム、 ゲル等のいづれの形状のものであって もよい。 経気道的投与剤は、 エアロゾルまたはその他の適当 な噴霧手段を用いて経気道的に投与される。
    [0057] 本発明の前記一般式 （ I ) のビタ ミ ン B 1 2誘導体又はその 医薬的に許容される塩を有効成分として舍む組成物の錠剤は、 例えば乳糖、 デンプン、 結晶セルロース等の賦形剤と、 必要 に応じ、 カルボキシメ チルセルロース、 メ チルセルロース、 ボリ ビニルビ口 リ ドン等の結合剤 ； および 又はアルギン酸 ナ ト リ ウム、 炭酸水素ナ ト リ ゥム等の崩壌剤等を有効成分に 混合し、 この混合物を通常の方法により成形することにより 製造される。 液剤、 又は懸濁剤を製造するには、 例えばト リ カプリ リ ン、 ト リ ァセチンなどのグリ セ リ ンエステル類、 ェ タノール等のアルコール類などを有効成分に混合し、 この混 合物に通常の方法を適用すればよい。 力プセル剤を製造する には、 顆粒剤、 散剤あるいは液剤などを有効成分とともにゼ ラチン等のカブセル形成材料に混合し、 これにカプセル成形 法を適用すればよい。
    [0058] 注射剤は、 水性あるいは非水性溶液剤などの形態に応じ、 有効成分を、 例えば生理食塩水、 エタノール、 プロピレング リ コールなどの溶媒に溶解し、 必要に応じて防腐剤、 安定剤 などを添加して製造される。
    [0059] 座剤としては、 有効成分を舍むゼラチンソフ トカプセル等 の通常の剤形のものが用いられる。
    [0060] 軟膏、 ク リーム等は、 有効成分と、 所要の担体とから、 通 常の方法によつて形成される。
    [0061] エアロゾル投与剤としては、 炭素数 6〜22の脂肪酸、 脂肪 酸多価アルコールまたはその環状無水物等から作られた、 医 薬的に許容される界面活性剤と、 炭素数 5以下のアルカ ンあ るいはフ ッ素化アル力ン等の噴射剤と、 有効成分とを用いて 製造することができる。
    [0062] かかる医薬製剤中の一般式 （ I ) のビタ ミ ン B 1 2誘導体及 びその医薬的に許容される塩の濃度には特に限定はないが、 一般には製剤中に 0.001〜50重量％程度、 好ましく は 0. 01〜 10重量％程度が適当である。 又、 その用量にも特に限定はな いが 0.01〜 500mgノ日ノ人、 好まし く は 0. 1 〜 lOOragノ日ノ 人が適当であり、 投与回数は通常 1 日当り 1 〜 4画である。
    [0063] H體
    [0064] 次に実施例を示して、 本発明を具体的に説明するが、 本発 明は、 実施例により限定されるもので.はない。 〔実施例 1 〕 2 — （ 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） ェチルシアノ コビンア ミ ドリ ン酸の合成 実施例 1 において以下の操作を行なつた。
    [0065] 1 ) 1 一 （ 2 — ヒ ドロキ シェチル） 一 5 , 6 —ジメ チルベン ズイ ミダゾールの合成
    [0066] 1. 46 g の 5 , 6 —ジメ チルベンズィ ミダゾ一ルを、 50 の 乾燥 N , N —ジメ チルホルムア ミ ドに溶解し、 0. 96 g の NaH を加え、 氷水浴中で 30分間攪拌した。 これに、 エチ レ ンクロ ルヒ ド リ ン 5 meを滴下し、 15時間室温で攙拌後、 さらに 0. 78 gの NaHを適宜添加しながら、 24時間反応を行った。 反応の 停止は、 50 ffl£の水を加えることにより行ない、 得られた反応 液は、 n—へキサ ンで洗浄後、 水を加え、 HC £ で pHを 2. 5 に 調整してから、 イオン交換カラム （ダウエックス 50 (水素ィ オ ン型））にかけた。 溶出は、 水、 30 %エタノール、 ア ンモニ ァ性 30 %エタノールで順次行い、 ァンモユア性 30 %エタノ一 ルで溶出される画分を滅圧下で濃縮乾固することにより、 粗 製 1 一 （ 2 — ヒ ドロキ シェチル） 一 5 , 6 —ジメ チルベンズ イ ミダゾールを得た。 この化合物への、 5 , 6 —ジメチルべ ンズィ ミダゾールからの変換率は、 薄層クロマ トグラフィー による検定で、 75 %であった。
    [0067] さらに、 得られた粗製 1 — ( 2 —ヒ ドロキシェチル） 一 5 6 —ジメ チルベンズィ ミダゾールを、 50 %メ タ ノ ールに溶解 し、 不溶物を除去後、 逆相の高速液体クロマ トグラフィ一に より精製を行ない、 減圧下で濃縮乾固して、 精製 1 一 （ 2 — ヒ ドロキ シェチ ，レ） 一 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾール を得た。
    [0068] 13C -画（CDC£ 3, δ ppm)
    [0069] 20.13, 20.51, 48.11, 60,43, 109.54, 119.59, 130.82， 131.83.
    [0070] 2 ) 2 —シァノ エチルリ ン酸ビリ ジン塩の調製
    [0071] テナーの方法（J.Am.Chem.Soc.,83巻、 159-168頁、 1961年） に従って、 2 —シァノエチルリ ン酸ピリ ジン塩の調製を行な つた。 すなわち、 2 —シァノ エチルリ ン酸バリ ウム塩 1.61 g とイオン交換樹脂 （ダウエ ックス 50 (水素イ オン型）） 10 gを 水中に懸濁し、 室温で 30分間攪拌した後、 その上清及び水に よる洗浄液にビリ ジン 2 ^を加えて、 減圧下で濃縮乾固し、 これにピリ ジンを加え、 I mmolZfflgの 2 —シァノ ェチルリ ン 酸ビリ ジン塩溶液を得た。
    [0072] 3 ) 2 — （ 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリル） ェチルリ ン酸の合成
    [0073] 0.19 g の粗製 1 一 （ 2 —ヒ ドロキシェチル） 一 5 , 6 —ジ メ チルベンズィ ミダゾールと 2 za£の 2 —シァノ エチルリ ン酸 ビリ ジン塩溶液 （ 1 mmolZ ) を乾燥ビリ ジン 20 ^に溶解し、 減圧下で濃縮乾固した。 この操作をさらに 2面繰り返し、 さ らに真空ポンプにて充分に乾燥させた後、 これを乾燥ビリ ジ ン 20fflfiに溶解し、 ジシク ロへキシルカルボジィ ミ ド 1.67 gを 添加して、 室温で 2 日間攪拌した。 これに水を加えてから、 減圧下で濃縮乾固を行ない、 次いで LiOH水溶液 （ 0. 5 N ) 40 ^を加えて、 45分間 100'Cで反応させた。 反応液を濾過して 濾液を得、 これに水を加え、 HC £で PHを 2. 5〜 3 に調整して から、 イ オ ン交換カ ラム （ダウエ ックス 50 (水素イオン型）） にかけた。 溶出は、 水、 2 Nピリ ジンで順次行ない、 後者で 溶出される面分を、 減圧下で濃縮乾固するこ とによって、 粗 製 2 — （ 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） ェチルリ ン 酸 0.27 gを得た。
    [0074] 4 ) シァノ アクアコビンア ミ ドの調製
    [0075] 1 g のシァノ コバラ ミ ン （ビタ ミ ン B ^ 2 ) を 144ffl£の水に 溶解し、 これに、 0.33Mの Ce(N03)3水溶液を 76.8ffl£及び 1 N の NaOH溶液を 51.2fflfi添加した。 次いで、 この混合物に、 1.77 gの KCNを加え、 90〜 100Ϊで 1時間攆拌した後、 室温まで 冷却し、 ρΗを 8. 5に調整してから、 4 'Cで一晩放置した。 こ れを濾過して、 その濾液を、 フユノール抽出による脱塩を行 なつてから、 イ オ ン交換カ ラム （ジェチルア ミノ エチルセル ロース （アセテー ト型））にかけた。 水で溶出される画分に小 量の酢酸を加え、 減圧下で濃縮乾固することにより、 粗製の シァノ アクアコビンア ミ ドを得た。 これを、 さらに、 ホスホ セルロースカ ラム （pH 7 ) にかけ、 50%ェタノ ール、 50mMの
    [0076] NaC £溶液で順次溶出し、 後者で溶出される画分を、 フユノ —ル抽出により脱塩して、 精製シァノアクアコビンアミ ドを
    [0077] 800ing得た。
    [0078] 5 ) 2 — ( 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） ェチルシ ァノ コビンア ミ ドリ ン酸の合成
    [0079] 0.27 gの粗製 2 — （ 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） ェチルリ ン酸、 及び 0. 2 gの精製シァノ アクアコ ビンア ミ ド をビリ ジン 5 ^に溶解し、 減圧下で濃縮乾固した。 この操作 をさらに 2回繰り返し、 さらに真空ポンプにて充分乾燥させ た後、 これに、 乾燥 N , N—ジメ チルホルムア ミ ド 15 fflfi、 乾 燥ビ ジ ン 10諕、 及びジシクロへキシルカルボジイ ミ ド 1. 5 gを加え、 室温で 12日間攙拌し、 水及び KCNの添加により反 応を停止させた。 反応混合物は、 フ ノール抽出により脱塩 を行なった後、 ホルホセルロースカラム （pH 3 ) にかけ、 次 いで、 その素通り画分を、 イ オ ン交換カ ラム （ジェチルア ミ ノ エチルセルロース （アセテー ト型））にかけた。 さ らに、 そ の素通り面分を、 逆相の高速液体ク口マ トグラフィ一で精製 し、 濃縮乾固品として、 50m の精製 2 - ( 5 , 6 —ジメチル ベンズィ ミダゾリ ル） ェチルシアノ コ ビンア ミ ドリ ン酸を得 た。 得られた 2 — （ 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリル） ェチルシアノ コビンアミ ドリ ン酸は、 逆相の高速液体ク 口マ トグラフィー、 及び薄層クロマ トグラフィ一にて、 単一であ ることが確認された。 さらに、 得られた 2 — （ 5 , 6—ジメ チルベンズィ ミダゾリ ル） ェチルシアノ コ ビンア ミ ドリ ン酸 をセ リ ウム加水分解することにより、 1 一 （ 2 —ヒ ドロキシ ェチル） 一 5 , 6 —ジメチルペンズィ ミダゾールが、 定性的 及び定量的に得られることを、 薄層クロマ トグラフィー及び 逆相の高速液体ク口マ トグラフィ一で確認した。
    [0080] 〔実施例 2 〕 3 - ( 5 , 6—ジメ チルペンズイ ミダゾリ ル） プロ ビルシァノ コ ビンア ミ ドリ ン酸の合成 実施例 2において以下の操作を行なつた。 1 ) 1 — ( 3 —ヒ ドロキシプロ ビル） 一 5 , 6 —ジメ チルべ ンズイ ミダゾールの合成
    [0081] 1.46 gの 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾ一ルを、 50 の 乾燥 N , N—ジメ チルホルムア ミ ドに溶解し、 0.76 g の NaH を加え、 室温で 30分間攪拌した。 これに、 3 —クロロー 1 — ブロバノール 5 ^を滴下し、 2 曰間室温で撹拌して反応させ た後、 水を加えて反応を停止させた。 以下、 実施例 1 と同様 の操作により、 粗製 1 一 （ 3 —ヒ ドロキシプロビル） 一 5 , 6 ージメ チルベンズィ ミダゾールを得た。 この化合物への、 5 , 6 —ジメ チルベンズィ ミダゾールからの変換率は、 90% であった。
    [0082] さ らに、 粗製 1 一 （ 3 —ヒ ドロキシプロ ピル） 一 5 , 6 - ジメチルペンズィ ミダゾールを、 50%メ タノ ールに溶解し、 逆相の高速液体ク ロマ トグラフ ィーで精製し、 減圧下で濃縮 乾固し、 精製 1 — ( 3 —ヒ ドロキシプロピル） 一 5 , 6 —ジ メ チルベンズィ ミダゾールを得た。
    [0083] 13C-NMR(CDC £ 2 , δ ppra)
    [0084] 20.04, 20.40, 31.71, 41.16, 58.47, 109.97, 120.38, 131.21, 132.28.
    [0085] ^-NMRCCDC ί 3) δ ppra)
    [0086] 2.0〜2.2(2H, m) , 2.35(3H, s) , 2.37(3H, s) ,
    [0087] 3.58C2H, t, J=6.0Hz), 4.30(2H, t, J=7.0Hz) ,
    [0088] 7.18C1H, s) , 7.54C1H, s) , 7.78(1H, s) . 2 ) 3 — （ 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） プロビル リ ン酸の合成
    [0089] 出発物質として、 粗製 1 一 （ 3 —ヒ ドロキシプロビル） 一 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾールを 0. 2 g、 及び 2 —シ ァノェチルリ ン酸ピリ ジン塩溶液 （ 1 mmo l Z me ) を 2 ^用い- 以下、 実施例 1 と同様の操作により、 粗製 3 — （ 5 , 6 —ジ メ チルベンズィ ミダゾリ ル） プロ ビルリ ン酸 0. 3 gを得た。
    [0090] 3 ) 3 — ( 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） プロ ビル シァノ コビンア ミ ドリ ン酸の合成
    [0091] 出発物質として、 粗製 3 — ( 5 , 6 —ジメ チルペンズィ ミダゾリル） プロビルリ ン酸を 0. 3 g、 及び精製シァノ アク アコビンアミ ドを 0. 2 g用い、 以下、 実施例 1 と同様の操作 により、 33mgの精製 3 — （ 5 , 6 —ジメ チルペンズイ ミダゾ リ ル） プロビルシアノ コ ビンア ミ ドリ ン酸を得た。 ただし、 反応時間は 3. 5 日とした。 また、 この化合物が単一であるこ との確認も、 実施例 1 と同様にして行なった。 さらに、 得ら れた 3 — ( 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） プロ ビル シァノ コビンアミ ドリ ン酸をセリ ウム加水分解することによ り、 1 一 （ 3 —ヒ ドロキシプロピル） 一 5 , 6 —ジメ チルべ ンズイ ミダゾールが、 定性的及び定量的に得られることを、 薄層クロマ トグラフィ ー及び逆相の高速液体クロマ トグラフ ィ一で確認し、 また、 その 1 3 C - NMB及び1 も、 実施例 2 の 1 ) で得られた 1 一 （ 3 —ヒ ドロキシプロ ビル） 一 5 , 6 ージメ チルベンズィ ミダゾールのそれに一致した。 〔実施例 3 〕 4 一 （ 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） プチルシアノ コビンアミ ドリ ン酸の合成 実施例 3において以下の操作を行なつた。
    [0092] 1 ) 1 一 （ 4 ーヒ ドロキシブチル） 一 5 , 6 —ジメ チルベン ズィ ミダゾールの合成
    [0093] 1. 46 gの 5 , 6 —ジメ チルベンズィ ミダゾールを、 50 »ώの 乾燥 Ν , Ν—ジメ チルホルムア ミ ドに溶解し、 0. 9 gの NaH を加え、 室温で 30分間攪拌した。 これに、 4 —ク ロロ ー 1 - ブタノール 8 ^を滴下して、 室温で 1 日攪拌した後、 さらに 0. 65 gの NaH、 及び 2 fflfiの 4 —ク ロ口一 1 —ブタノールを適 宜添加して、 8 日間反応を行なった。 以下、 実施例 1 と同様 の操作により、 粗製 1 一 （ 4 ーヒ ドロキシブチル） 一 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾールを得た。 この化合物への、 5 6 —ジメチルべンズィ ミダゾールからの変換率は、 50 %であ つた。
    [0094] 2 ) 4 - ( 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） プチルリ ン酸の合成
    [0095] 出発物質として、 粗製 1 一 （ 4 ーヒ ドロキシブチル） 一 5 6 —ジメ チルペンズィ ミダゾールを 0. 2 g、 及び 2 —シァノ ェチルリ ン酸ピリ ジン塩溶液 （ 1 mmo lノ^ ) を 2 ^用い、 以 下、 実施例 1 と同様の操作により、 粗製 4 一 （ 5 , 6 —ジメ チルベンズィ ミダゾリ ル） ブチルリ ン酸 0. 3 gを得た。
    [0096] 3 ) 4 - ( 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリル） プチルシ ァノ コ ビンア ミ ドリ ン酸の合成
    [0097] 出発物質として、 粗製 4 — ( 5 , 6 —ジメ チルベンズィ ミ ダゾリル） ブチルリ ン酸を 0· 3 g、 及び精製シァノアクアコ ビンア ミ ドを 0. 2 g用い、 以下、 実施例 1 と同様の操作によ り、 15mgの精製 4 — ( 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） プチルシアノ コビンアミ ドリ ン酸を得た。 ただし、 反応時間 は 6 日とした。 また、 この化合物の確認は、 薄層クロマ トグ ラフィーを用いて、 実施例 1 と同様の操作により行なった。
    [0098] 〔実施例 4 〕 6 — （ 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） へキ シルシアノ コ ビンア ミ ド リ ン酸の合成 実施例 4において以下の操作を行なつた。
    [0099] 1 ) 1 一 （ 6 —ヒ ドロキ シへキシル） 一 , 6 —ジメ チルべ ンズイ ミダゾールの合成
    [0100] 1. 46 g の 5 , 6 —ジメ チルベンズィ ミダゾールを、 50 fflfiの 乾燥 N , N —ジメ チルホルムア ミ ドに溶解し、 0. 84 g の NaH を加え、 さ らに 8. 2 ^の 6 —ク ロ口 一 1 —へキサノールを添 加して、 1 日間室温で攪拌して反応させた後、 水を加えて反 応を停止させた。 以下、 実施例 1 と同様の操作により、 粗製
    [0101] 1 一 （ 6 — ヒ ドロキ シへキ シル） 一 5 , 6 —ジメ チルベンズ イ ミダゾールを得た。 この化合物への、 5 , 6 —ジメチルべ ンズィ ミダゾールからの変換率は、 95 %以上であった。
    [0102] 2 ) 6 — （ 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） へキ シル リ ン酸の合成
    [0103] 出発物質として、 粗製 1 一 （ 6 — ヒ ドロキシへキシル） 一 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾールを 0. 2 g、 及び 2 — シ ァノ エチルリ ン酸ピリ ジン塩溶液 （ 1 mmo lノ^ ) を 2 fflfi用い、 以下、 実施例 1 と同様の操作により、 粗製 6 — （ 5 ， 6 —ジ メ チルベンズイ ミダゾリ ル） へキシルリ ン酸 0· 35 gを得た。
    [0104] 3 ) 6 — ( 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） へキシル シァノ コ ビンア ミ ドリ ン酸の合成
    [0105] 出発物質として、 粗製 6 — （ 5 , 6 —ジメチルペンズイ ミ ダゾリ ル） へキシルリ ン酸を 0. 35 g、 及び精製シァノ アクア コビンァ ミ ドを 0. 2 g用い、 以下、 実施例 1 と同様の操作に より、 20 m の精製 6 — （ 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） へキシルシアノ コ ビンア ミ ドリ ン酸を得た。 ただし、 反 応時間は 5 日とした。 この化合物の確認は、 薄層クロマ トグ ラフィーを用いて、 実施例 1 と同様の操作により行なった。
    [0106] 〔実施例 5 〕 3 —ィ ミダゾリ ルプロビルシァノ コ ビンア ミ ド リ ン酸の合成
    [0107] 実施例 5において以下の操作を行なつた。
    [0108] 1 ) 1 一 （ 3 —ヒ ドロキシプロ ビル） イ ミダゾールの合成
    [0109] 1. 7 g のィ ミダゾ一ルを、 125 のジォキサンに溶解し、 これに炭酸カリ ウム 17. 25 gを加え、 さらに 13. 8 ffl£の 3 —ク ロロ一 1 ープ πパノールを滴下して、 Ί. 5時間還流加熱した < 得られた反応混合物は、 濾過により炭酸力 リ ゥムを除いた後. 水を加えて反応を停止させ、 pHを 2. 5 に調整してから、 ィォ ン交換カラム （ダウエックス 50 (水素イ オ ン型））にかけた。 溶出は、 水、 30 %エタノール、 ア ンモニア性 30 %エタノール で順次行ない、 ァンモニァ性 30 %ェタノ一ルで溶出される画 分を濃縮し、 これを、 ホスホセルロースカ ラム ( pH 8 ) にか け、 素通り画分を、 減圧下で濃縮乾固することにより、 2. 5 gの精製 1 一 （ 3 —ヒ ドロキシプロビル） イ ミダゾールを得 た。
    [0110] 13C-隱（D20, δ ppm)
    [0111] 34.86, 45.75, 60.51, 122.54, 130.05, 140.26.
    [0112] 2 ) 3 —イ ミダゾリ ルプロ ビルリ ン酸の合成
    [0113] 出発物質として、 精製 1 — ( 3 —ヒ ドロキ シプロビル） ィ ミ ダゾールを 0.13 g、 及び 2 — シァノ エチルリ ン酸ピリ ジ ン 塩溶液 （ 1 mmol ^) を 2 用い、 以下、 実施例 1 と同様の 操作により、 粗製 3 —ィ ミダゾリルプロビルリ ン酸 0. 2 gを 得た。
    [0114] 3 ) 3 —ィ ミダゾリ ルプロビルシァノ コ ビンア ミ ド リ ン酸の 合成
    [0115] 出発物質として、 粗製 3 —ィ ミダゾリルプロビルリ ン酸を 0. 2 g、 及び精製シァノ アク アコ ビンア ミ ドを 0. 2 g用い、 以下、 実施例 1 と同様の操作により、 20mgの精製 3 —イ ミダ ゾリルプロビルシァノ コビンア ミ ドリ ン酸を得た。 ただし、 反応時間は 3週間とした。 また、 この化合物の確認は、 逆相 の高速液体ク ロマ トグラ フィー、 13C-NMR、 及び1 H-NMRで、 実施例 2 と同様の操作により行なつた。
    [0116] 〔実施例 6 〕 2 — ( 5 , 6 — ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） ェチルアデノ シルコ ビンア ミ ド リ ン酸の調製 lOmgの 2 — （ 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） ェチ ルシアノ コビンア ミ ドリ ン酸を 3 ^の水に溶解し、 これに、 lOOmgの NaBH4 を添加し、 密封した。 これを 15分間放置して 還元した後、 暗所で、 25mgの 5 ' —ョー ド一 5 ' —デォキシ アデノ シンを 3 fflfiの N , N—ジメ チルホルムア ミ ドと共に、 この密封容器中に注入し、 水冷しながら、 さ らに 30分間放置 した。 以下の操作は暗所で行なった。 得られた反応液に、 水 及び 1 Mリ ン酸カ リ ゥム緩衝液 （pH5. 0 ) を加え、 次いで、 これを吸着カラム （アンバーライ ト XAD-2)にかけ、 水、 80% エタノールで順次溶出した。 後者で溶出される画分を、 減圧 下で濃縮乾固した後、 少量の水に溶かし、 これをイ オン交換 カラム （カルボキシメ チルセルロース （水素イオン型））にか け、 水、 50mMの NaC £溶液で順次溶出した。 後者で溶出され る西分を、 吸着カ ラム （ア ンバーライ ト XAD-2)によって脱塩 後、 さ らに、 イ オ ン交換カ ラム （ホスホセルロースカ ラム
    [0117] (pH 6 ))により精製を行ない、 減圧下で濃縮乾固して、 精製 2 — （ 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） ェチルアデノ シルコ ビンア ミ ドリ ン酸を得た。
    [0118] 〔実施例 7 〕 3 — （ 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリル） プロビルアデノ シルコ ビンア ミ ドリ ン酸の調製 実施例 7 において、 実施例 6 の 2 — ( 5 , 6 —ジメ チルべ ンズィ ミダゾリ ル） ェチルシアノ コ ビンア ミ ドリ ン酸の代わ り に、 3 — ( 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） プロ ビ ルシアノ コビンア ミ ドリ ン酸を用いて、 実施例 6 と同様の操 作により、 3 — ( 5 , 6 —ジメ チルペンズイ ミダゾリ ル） プ 口 ビルアデノ シルコ ビンア ミ ドリ ン酸を得た。 〔実施例 8 〕 4 - ( 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） ブチルアデノ シルコ ビンア ミ ドリ ン酸の調製 実施例 8 において、 実施例 6 の 2 — （ 5 , 6 —ジメ チルべ ンズィ ミダゾリ ル） ェチルシアノ コ ビンア ミ ドリ ン酸の代わ りに、 4 — ( 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） ブチル シァノ コ ビンア ミ ドリ ン酸を用いて、 実施例 6 と同様の操作 により、 4 一 （ 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） ブチ ルアデノ シルコ ビンアミ ドリ ン酸を得た。
    [0119] 〔実施例 9 〕 6 — ( 5 , 6 —ジメ チルペンズイ ミダゾリル） へキシルアデノ シルコ ビンア ミ ドリ ン酸の調製 実施例 9 において、 実施例 6 の 2 — （ 5 , 6 —ジメ チルべ ンズィ ミダゾリ ル） ェチルシアノ コ ビンア ミ ドリ ン酸の代わ りに、 6 — （ 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリル） へキシ ルシアノ コビンア ミ ドリ ン酸を用いて、 実施例 6 と同様の操 作により、 6 _ ( 5 , 6 —ジメ チルベンズイ ミダゾリ ル） へ キシルアデノ シルコ ビンア ミ ドリ ン酸を得た。
    [0120] 〔実施例 10〕 3 ーィ ミダゾリ ルプロビルアデノ シルコビンァ ミ ドリ ン酸の調製
    [0121] 実施例 10において、 実施例 6 の 2 — （ 5 ， 6 —ジメ チルべ ンズィ ミダゾリノレ） ェチルシアノ コ ビンア ミ ドリ ン酸の代わ りに、 3 —イ ミダゾリ ルプロ ピルシアノ コ ビンア ミ ドリ ン酸 を用いて、 実施例 6 と同様の操作により、 3 —イ ミダゾリ ル プロビルアデノ シルコ ビンア ミ ドリ ン酸を得た。 〔実施例 11〕 ビタ ミ ン B 12誘導体の補酵素活性の測定
    [0122] 実施例 1〜10において調製されたビタ ミ ン B 12誘導体の補 酵素活性を、 以下に示した 2つの方法により測定した。
    [0123] 1 ) 3 —メ チルー 2 —ベンゾチアゾリ ノ ンヒ ドラゾンを用い た補酵素活性の測定
    [0124] 虎谷らの方法（J.Biol. Chem., 252巻、 963-970買、 1977年） に従って行なった。
    [0125] 酵素として、 ジオールデヒ ドラーゼを用いた。 本酵素は、 アデノ シルコバラ ミ ン、 すなわちビタ ミ ン B 12補酵素を補酵 素とする酵素であり、 ビタ ミ ン B 12補酵素 （アデノ シルコ バ ラ ミ ン） 非存在下では作用を示さない。 ジオールデヒ ドラー ゼは、 ポズナンスカャらの方法（Arch. Biochem. Biophys. , 194 卷、 379-386頁、 1979年） に従い、 ク レブシエラ ' 二ゥモニ ァ (Klebsiella pneumoniae ATCC 8724) より高度に精製し、 0.05Mリ ン酸力 リ ウム緩衝液 （pH8. 0 ) で、 0.3 Unit/ ^の 溶液にした。 本酵素の基質としては、 1 Mの 1 , 2 —プロパ ンジオール水溶液を用いた。
    [0126] 氷浴中で、 0. l fflfiの基質溶液、 0. 1 の 0. 5 M塩化力 リ ウ ム水溶液、 0. 1 ra£のジオールデヒ ドラーゼ溶液、 及び 0. 6 の 0.05Μリ ン酸カ リ ゥム緩衝液 （ρΗ8.0 ) を混合し、 これに、 暗所で、 0.2 mMのビタ ミ ン Β 12補酵素 （アデノ シルコバラ ミ ン） 、 ビタ ミ ン B , 2 (シァノ コバラ ミ ン） 、 または実施例 1 〜： L0において調製された各ビタ ミ ン B 12誘導体 0. 1 fflfiを添加 した。 これを、 暗所で 10分間 37てに保温後、 1 の 0. 1 ク ェン酸カ リ ウム緩衝液 （ΡΗ3. 6 ) を加えて、 酵素反応を停止 させ、 0. 1 %の 3 —メ チルー 2 —べンゾチアゾリ ノ ンヒ ドラ ゾン水溶液 0. 5 を添加し、 さらに 15分間 37'Cで保温を続け た。 これに、 水 1 を加え、 島津ダブルビーム分光光度計 UV- 140-02型にて、 305nmの吸光度を測定することにより、 補酵 素活性 （ k cat ) を箕出した。
    [0127] 2 ) アルコールデヒ ドロゲナーゼ及び還元型ニコチンアミ ド アデニンジヌク レオチ ドを用いた補酵素活性の測定 虎谷らの方法 （Biochemistry, 18巻、 417-426頁、 1979年） に従って行なった。
    [0128] ジオールデヒ ドラーゼは、 0.05Mリ ン酸カ リ ゥム緩衝液
    [0129] ( H 8. 0 ) で O.lSUnitZfflfiにしたものを用い、 その基質とし ては、 1 M0 1 , 2 —プロパンジオール水溶液を用いた。 ま た、 0.05Mリ ン酸カ リ ゥム緩衝液 （pH8.0 ) により、 0. 5 m / fflgのアルコールデヒ ドロゲナーゼ、 及び 2 mhlの還元型ニコ チンア ミ ドアデニンジヌク レオチ ドを調製した。 0. I fflSの基 質溶液、 0. 1 meのアルコールデヒ ドロゲナーゼ溶液、 0. 1 ffig の還元型ニコチンア ミ ドアデニンジヌク レオチ ド溶液、 及び 0. 5 の 0.05Mリ ン酸力 リ ウム緩衝液 （ρΗ8. 0 ) を混合し、 これに、 0. 1 ragのジオールデヒ ドラーゼ溶液を添加した。 こ れを、 5分間 37'Cで保温した後、 暗所で、 0. 2 mMのビタ ミ ン B t 2捕酵素 （アデノ シルコバラ ミ ン） 、 ビタ ミ ン B , 2 (シァ ノ コバラ ミ ン） 、 または実施例 1〜10において調製された各 ビタ ミ ン B 12誘導体 0. 1 mfiを添加し、 ュニォン分光光度計 SM- 401 にて、 340nmの吸光度の減少を経時的に追跡することに より、 補酵素活性 （ k cat ) を算出した。 上記の 1 ) または 2 ) の方法で算出された補酵素活性
    [0130] ( kcat ) を表 1に示した。 kcat が大きいほど補酵素活性 が強いことを示す。 ビタ ミ ン B 12補酵素 （アデノ シルコバラ ミ ン） の補酵素活性に対する相対活性 （％) も表 1に示した。 実施例 6及び実施例 9において調製されたビタ ミ ン B 12誘導 体は、 補酵素活性を示さなかった。
    [0131] 〔実施例 12〕 ビタ ミ ン B 12誘導体のミハエリ ス定数及び （ま たは） 阻害定数の測定
    [0132] 実施例 11において、 補酵素活性を示したビタ ミ ン B 12誘導 体については、 ミハエリス定数 （ Km ) を求めた。 すなわち、 実施例 11の方法 1 ) において、 ビタ ミ ン B 12誘導体の濃度を 適宜変えることによって、 それぞれの酵素活性を測定し、 ラ イ ンウェーバー ' バーク · プロ 'ン トにより ミハエ リ ス定数 ( Kn ) を求めた。 結果は表 1に示した。 Kra が小さいほど 酵素との親和性 （結合性） が強いことを示す。
    [0133] また、 実施例 11において、 補酵素活性を示さなかったビタ ミ ン B l2誘導体については、 阻害定数 （ Ki ) を求めた。 す なわち、 実施例 11の方法 1 ) において、 一定量の各ビタ ミ ン B , 2誘導体の濃度に対して、 ビタ ミ ン B 12補酵素 （アデノ シ ルコバラ ミ ン） の濃度を適宜変えて添加することによって、 このときの酵素活性をそれぞれ測定し、 ライ ンウェーバー - バーク · プロ ッ トにより阻害定数 （ K i ) を求めた。 結果は 表 1に示した。 Ki が小さいほど阻害活性が強いことを示す k c a t m K i 化 合 物
    [0134] (s-リ (%) ( ） (
    [0135] 対 照 例
    [0136] (ヒタ ン Β 12 337 100 0.80
    [0137] 補酵素）
    [0138] 実施例 6 - - - 52
    [0139] " 7 199 59 0.82 -
    [0140] " 8 167 50 11.2 -
    [0141] » 9 - - - 38
    [0142] 〃 10 3 0.9 1.1 1.0 ビタ ミ ン Β , 2 1.9 実施例 1 24
    [0143] » 2 0.9
    [0144] " 3 3.0
    [0145] " 43
    [0146] " 5 3.7
    [0147] 〔実施例 13〕 ビタ ミ ン B , 2誘導体のェシエリ ヒア · コ リ
    [0148] (Escherichia col i) 215に対する増殖促進活性 及び増殖阻害活 W
    [0149] ェシエ リ ヒア · コ リ (Escherichia coli) 215はビタ ミ ン
    [0150] B 12要求性の変異株であり、 池田らによって見出され、 ビタ ミ ン B 12のバイ オア ツセィ に用いられている （ビタ ミ ン、 10 巻、 268-279頁、 1956年） 。 すなわち、 この菌は、 ビタ ミ ン
    [0151] B , 2の非存在下では増殖できず、 ビタ ミ ン B 12依存的に増殖 を示す
    [0152] 本実験に用いた、 ェシエリ ヒア ' コ リ (Escherichia coli ) 215 の培地組成を表 2に示した。
    [0153] 2
    [0154] 表 2 に示した培地に、 ビタ ミ ン B , 2 (シァノ コバラ ミ ン） 、 または実施例 1〜 5 において合成された各ビタ ミ ン Β 12誘導 体を、 それぞれ 0. 1 〜 の濃度範囲で濃度を変えて 分注し、 これを 5分間 120'Cで蒸圧滅菌した。 これらの培地 に、 予め、 L _メ チォニン 1. 5 ^を舍む表 2に示した培 地と同じ組成の前培養培地で培養しておいたヱシヱリ ヒア · コ リ (Escherichia co 1 ί ) 215菌体を集菌後、 生理食塩氷で 充分洗浄してから接種し、 37てで一晩静置培養した。 これら の培養液の濁度を島津ダブルビーム分光光度計 ϋν-140-02 型 を用いて、 660nmで測定することにより、 菌体の増殖度とし た。 最大増殖の 2分の 1 を与えるビタ ミ ン B 12 (シァノ コバ ラ ミ ン） 、 または各ビタ ミ ン B 12誘導体のモル濃度を增殖促 進活性 （ K ) と定義し、 結果を表 3に示した。 K が小さいほど増殖促進活性が強いことを示す。 実施例 1〜 5 において合成されたビタ ミ ン B 12誘導体は、 増殖促進活性を 示さなかった。
    [0155] また、 表 2に示した培地に、 ビタ ミ ン B , 2 (シァノ コバラ ミ ン） を 0.1 ngZfflfiの濃度となるように添加し、 さらに、 実 施例 1〜 5において合成されたビタ ミ ン B 12誘導体を、 それ ぞれ 1〜80ngZ の濃度範囲で濃度を変えて分注し、 これを 5分間 120'Cで蒸圧滅菌した。 これらの培地に、 前記と同様 の方法で前培養して、 集菌、 洗浄した菌体を接種し、 37てで 一晩静置培養した後、 菌体の増殖度を培養液の濁度（660nm) で求めた。 また、 ビタ ミ ン B 12誘導体を添加しないで同様の 実験を行ない、 このときの増殖度の 2分の 1を与える、 各ビ タ ミ ン B 12誘導体添加モル濃度を増殖阻害活性 （ K1/2( ) と定義した。 さ らに、 次式 （V)
    [0156] ID50= K 1/2 (i) / C (V) (式中 Cは、 用いたビタ ミ ン B1Z (シァノ コノ ラ ミ ン） のモ ル濃度を示す。 ）
    [0157] により、 ビタ ミ ン B 12誘導体の拮抗阻害活性の指標として、 ID50を算出した。 結果は表 3に示した。 K1/2 (i>が小さいほ ど増殖阻害活性が、 ID50が小さいほど拮抗阻害活性が強いこ とを示す。 3
    [0158]
    [0159] 〔実施例 14〕 ビタ ミ ン B 12誘導体のラク トバチルス · ライ ヒ
    [0160] マ 二 (Lactobacillus leichraanni i) ATCC 7830 に対する增殖促進活性及び増殖阻害活性
    [0161] ラ ク ト ノ チノレス · ラ イ ヒマ二 ( Lactobaci 1 lus leichmannii) は、 スケッダスらにより、 ビタ ミ ン B 12要求性であることが 見出され（J.Biol. Chem, , 184卷、 211-221頁、 1950年） 、
    [0162] Lactobacillus leichmannii ATCC 7830を用いたビタ ミ ン
    [0163] B 12定量用のキ ッ トは市販品として容易に入手できる。 すな わち、 日水製薬のラ イ ヒマ二用ビタ ミ ン B 1 Z定量用基礎培地
    [0164] 「二 ッ スィ j を、 ラ ク ト ノ チルス · ラ イ ヒマ二 (Lactobacillus leichmanniDATCC 7830の培地として用い、 説明書に記載の 方法に従って、 培地を調製し、 これに、 ビタ ミ ン B 12 (シァ ノ コ バラ ミ ン） 、 または実施例 1〜 5において合成されたビ タ ミ ン B 12誘導体を、 それぞれ 0. 1〜 100ngZffl£の濃度範囲 で濃度を変えて分注し、 5分間 120てで蒸圧滅菌した。 これ らの培地に、 所定の方法に従って、 菌体を接種し、 37'Cで一 晩静置培養した。 菌体の増殖度は、 実施例 13に記載した方法 と同様にして測定し、 増殖促進活性 （ Kl/2 (3> ) を求めた。 結果は表 4に示した。 本菌に対して、 実施例 2〜4において 合成されたビタ ミ ン Β 12誘導体は増殖促進活性を示したが、 非常に弱いものであった。 また、 実施例 1及び実施例 5 にお いて合成されたビタ ミ ン Β 12誘導体は、 増殖促進活性を示さ なかった。
    [0165] また、 上記の基礎培地に、 ビタ ミ ン B 12 (シァノ コバラ ミ ン） を 0.05ngノ^の濃度となるように添加し、 さらに、 実施 例 1〜 5において合成されたビタ ミ ン B 2誘導体を、 それぞ れ適宜濃度を変えて添加し、 これを 5分間 120てで蒸圧滅菌 した。 これらの培地に、 所定の方法に従って、 菌体を接種し、 37'Cで一晩静置培養し、 菌体の増殖度を実施例 13に記載した 方法と同様にして測定した。 また、 ビタ ミ ン B 12誘導体を添 加せずに同様の実験を行ない、 実施例 13に記載された方法に 従って、 増殖阻害活性 （ K1/2 (i> ) 、 及び拮抗阻害活性（IDS0) を求めた。 その結果を表 4に示した。
    [0166]
    [0167] 〔実施例 15〕 ビタ ミ ン Β 12誘導体の、 マウ ス白血病 L 121。細 胞に対する l 増殖阻害活性 本実験に用いたマウ ス白血病 L l 21。細胞は、 D B Aマ ウ ス の腹腔内で増殖 · 維持したものを腹水と共に無菌的に取り出 し、 ゥ シ胎仔血情 （ 5 V v°/0)及びエタ ノ ールァ ミ ン （ 1. 2 m / £ ) を含む動物細胞培養用の RPMI-1640培地からビタ ミ ン B , 2 ( シァノ コ バラ ミ ン） を除去した培地に適応させて培 養した。 また本培地 1 にっき抗菌剤としてべニシリ ンを 10 万単位、 ス ト レプ トマイ シ ンを lOOmg添加した。 in vitroで 増殖適応させた L 12 l。細胞はさ らに藤井らの方法 （J.Biol. Chem. , 256巻、 10329- 10334頁、 1981年） に従い、 ゥ シ胎仔 血清の代りにゥ シ血清アルブミ ンを 7.0 g / £濃度で舍有す る上記培地に適応させた後実験に供した。
    [0168] 実施例 2及び 5 において合成されたビタ ミ ン B , 2誘導体の L 1210増殖阻害活性を調べる目的には、 まずアルブミ ンに適 応させた L 121。細胞を 10 濃度の葉酸を舍む同培地に 5 X104 cellsZflifiの密度で接種し、 湿気を舍む C02/air( 5 %ノ 95 %) 気下、 3 日間 37'Cで前培養を行なった。 増殖した細胞を 遠心分離した後、 葉酸を舍まない同培地で 2画洗浄し、 約 5 Xl06cells " の接種細胞懸濁液を調製した。 本培養はアル ブミ ンを舍む上記基本培地に葉酸の代りに 5 —メ チルテ トラ ヒ ド口葉酸を 10/ίΜ、 ビタ ミ ン Β 12 (シァノ コバラ ミ ン） を
    [0169] 0.5 ηΜになるように添加し、 これに洗浄した細胞を 5 X 104 cellsZmfi密度で接種し、 上記条件下で 9 日間迄培養を続け た。 実施例 2及び 5において合成されたビタ ミ ン B 12誘導体 の L 121。細胞增殖阻害活性は本培養の際に、 ビタ ミ ン B 12要 求性を增幅させる目的で添加したメ ソ ト レキセ一 ト（MT3 200 nMと実施例 2のビタ ミ ン B 1 Z誘導体 （50nM) 、 実施例 5 のビ タ ミ ン B 12誘導体 （50nM, 5000n ) を各々共存させることに より調べた。 M T X、 及び MT Xと本発明のビタ ミ ン B 12誘 導体共存下の場合のマウス白血病 L 121。に対する増殖阻害活 性を、 Coulter計測器による 3 , 5 , 7及び 9 日目の細胞密 度の測定で明らかにした結果を第 1図に示す。 なお、 対照例
    [0170] (コ ン トロール） として MT X及び本発明のビタ ミ ン B 12誘 導体の両者無添加の場合の増殖測定結果も同時に第 1図に示 す。 第 1図から、 本発明の化合物は L 121。に対して増殖抑制 作用を示し、 抗腫瘍作用があることが明らかである。
    [0171] 第 1図に示した 9 日目の培養細胞 （図中、 曲線 Eで示され る実施例 5で得られた本発明のビタ ミ ン B 12誘導体 （ 5000nM) を添加して培養したもの） を ト リバン · ブル一で染色するこ とにより生死判定を行なつた所、 MT X単独添加の場合には 20%の細胞が死滅しているにすぎないのに対し、 M T Xと実 施例 5のビタ ミ ン B 12誘導体を共存させた場合には 90%の細 胞が死滅していた。
    权利要求:
    Claims

    L 一般式 （ I ) ：
    C0NH;
    一一青
    車
    囲
    ）
    (式中、 Lはコ リ ン環のコ バル トへの配位子を示し、 Bは複 素環式構造を有する塩基を示し、 Rは置換または非置換の炭 化水素基を示す）
    で表わされるビタ ミ ン B 1 2誘導体及びその塩。
    2. Lが、 シァノ基、 置換もし く は非置換のアデノ シル基 もしく はアデニニルアルキル基、 ヒ ドロキシル基、 水分子、 及び炭素数 1 〜 8の直鎖も し く は分技鎖のアルキル基から選 ばれる 1個又は同一もし く は異なる 2個の配位子である請求 の範囲 1記載のビタ ミ ン B 1 2誘導体及びその塩。
    3. 尺が、 芳香族基もしく はハロゲン原子で置換されたま たは非置換の、 炭素数 1 〜 8の直鎖もしく は分枝鎖のアルキ レン基または環状の炭化水素基である請求の範囲 1記載のビ タ ミ ン B 1 2誘導体及びその塩。
    4. Rが、 炭素数 1 〜 8の直鎖のアルキレン基である請求 の範囲 1記載のビタ ミ ン B 1 2誘導体及びその塩。
    5. Bが、 置換または非置換の、 イ ミダゾール基、 ビリ ジ ン基、 またはそれらの誘導体である請求の範囲 1記載のビタ ミ ン B 1 2誘導体及びその塩。
    6. シァノ アクアコ ビンア ミ ドも し く はジシァノ コ ビンァ ミ ドを出発物質として一般式 （ I )
    CO H^
    z
    (式中、 Lはコ リ ン環のコバル トへの配位子を示し、 Bは複 素環式構造を有する塩基を示し、 Rは置換または非置換の炭 化水素基を示す。 ）
    で表わされるビタ ミ ン 8 , 2誘導体及びその塩の製造方法にお いて、 ① シァノアクアコビンアミ ドもしく はジシァノ コビンァ ミ ドと下記式 （ H )
    B-R-0P03H2 ( H )
    (式中、 B及び Rは前記式 （ I ) の定義に同じ。 ）
    で表わされる リ ン酸エステル誘導体又はその塩とを縮合反応 に付して、 前記式 （ I ) において Lがシァノ基であるビタ ミ ン B 12誘導体を製造すること、
    ② 前記①で得られた、 前記式 （ I ) において Lがシァノ 基であるビタ ミ ン B 12誘導体を還元反応に付し、 次いで a ) 酸化反応に付すか、 b ) アルキル化した後光分解することに より、 前記式 （ I ) において Lがヒ ドロキシル基、 又は水分 子であるビタ ミ ン B 12誘導体を製造すること、 あるいは
    ③ 前記①または②で得られた、 前記式 （ I ) において L がシァノ基、 ヒ ドロキ シル基、 または水分子であるビタ ミ ン B 12誘導体を還元反応に付し、 次いでハロゲン化された炭素 数 I〜 8の直鎖もし く は分技鎖のアルカ ン、 またはハロゲン 化もし く は ト シル化された置換もしく は非置換のアデノ シン もしく はアデニニルアルカ ンと反応させることにより、 前記 式 （ I ) において Lが炭素数 1〜 8の直鎮もし く は分技鎮の アルキル基、 置換もし く は非置換のアデノ シル基もしく はァ デニニルアルキル基であるビタ ミ ン B 12誘導体を製造するこ と
    を特徴とするビタ ミ ン B 12誘導体及びその塩の製造方法。
    7. Bが、 置換または非置換の、 イ ミダゾール基、 ビリ ジ ン基、 またはそれらの誘導体である請求の範囲 6記載のビタ ミ ン B 12誘導体及びその塩の製造方法。
    8. Rが、 芳香族基もし く はハロゲン原子で置換されたま たは非置換の、 炭素数 1〜 8の直鎮もしく は分技鎖のアルキ レン基または環状の炭化水素基である請求の範囲 6記載のビ タ ミ ン B 12誘導体及びその塩の製造方法。
    9. 次式 （ Π )
    B-R-0-P03H2 ( E )
    (式中、 Bは複素環式構造を有する塩基を示し、 Rは置換ま たは非置換の炭化水素基を示す。 ）
    で表わされる リ ン酸エステル誘導体及びその塩。
    10. Bが、 置換または非置換の、 イ ミダゾール基、 ビリ ジ ン基、 またはそれらの誘導体である請求の範囲 9記載のリ ン 酸エステル誘導体及びその塩。
    11. Rが、 芳香族基もしく はハロゲン原子で置換されたま たは非置換の、 炭素数 1〜 8の直鎖もし く は分技鎮のアルキ レン基または環状の炭化水素基である請求の範囲 9記載のリ ン酸ヱステル誘導体及びその塩。
    12. 複素環式構造を有する遊離の塩基 B ' を、 一般式 （ ΠΙ )
    X-R-0H ( I )
    (式中、 Xは脱離基を示し、 Rは置換または非置換の炭化水 素基を示す。 ）
    で表わされる化合物と反応させ、 一般式 （IV)
    B-R-OH (IV) (式中、 Bは複素環式構造を有する塩基を示し、 Rは前記式 ( I ) の定義に同じ。 ） で表わされる化合物を得、 次いでリ ン酸化反応に付すことを 特徴とする請求 ώ範囲 9記載の一般式 （ Π ) で表わされる リ ン酸エステル誘導体及びその塩の製造方法。
    13. 複素環式構造を有する遊離の塩基 Β ' が、 置換または 非置換の、 イ ミダゾール、 ビリ ジン、 またはそれらの誘導体 である請求の範囲 12記載のリ ン酸ヱステル誘導体及びその塩 の製造方法。
    14. Rが、 芳香族基もし く はハロゲン原子で置換されたま たは非置換の、 炭素数 1 〜 8 の直鎖もし く は分技鎖のアルキ レン基または環状の炭化水素基である請求の範囲 12記載のリ ン酸エステル誘導体及びその塩の製造方法。
    15. リ ン酸化反応を、 2 —シァノエチルリ ン酸ピリ ジン塩 を用いて行なう ことを特徴とする請求の範囲 12記載のリ ン酸 エステル誘導体及びその塩の製造方法。
    16. 請求の範囲 1記載の一般式 （ I ) で表わされるビタ ミ ン Β 1 2誘導体又はその医薬的に許容される塩を有効成分とし て含有するビタ ミ ン Β 1 2拮抗剤。
    17. 請求の範囲 1記載の一般式 （ I ) で表わされるビタ ミ ン Β 1 2誘導体又はその医薬的に許容される塩を有効成分とし て舍有する細胞増殖抑制または阻害剤。
    18. 請求の範囲 1記載の一般式 （ I ) で表わされるビタ ミ ン Β 1 2誘導体又はその医薬的に許容される塩を有効成分とし て舍有する抗腫瘍剤。
    19. 請求の範囲 1記載の一般式 （ I ) で表わされるビタ ミ ン Β 1 2誘導体又はその塩を用いて、 ビタ ミ ン Β 1 2高生産性微 生物変異株のスクリーユングをする方法,
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    申请号 | 申请日 | 专利标题
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